同其他色譜過(guò)程一樣，HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續多次交換過(guò)程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。

　　沃特世HPLC液相色譜開(kāi)始樣品加在柱頭上，假設樣品中含有3個(gè)組分，A、B和C，隨流動(dòng)相一起進(jìn)入色譜柱，開(kāi)始在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配。分配系數小的組分A不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數大的組分C在固定相上滯留時(shí)間長(cháng)，較晚流出色譜柱。組分B的分配系數介于A(yíng)，C之間，第二個(gè)流出色譜柱。若一個(gè)含有多個(gè)組分的混合物進(jìn)入系統，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數的不同先后流出色譜柱，達到分離之目的。
 

　　不同組分在色譜過(guò)程中的分離情況，取決于各組分在兩相間的分配系數、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學(xué)平衡問(wèn)題，也是分離的首要條件。

　　其次，沃特世HPLC液相色譜當不同組分在色譜柱中運動(dòng)時(shí)，譜帶隨柱長(cháng)展寬，分離情況與兩相之間的擴散系數、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動(dòng)相的流速等有關(guān)。所以分離終效果則是熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)兩方面的綜合效益。